現(xiàn)有的針對ctDNA的MRD檢測主要有2條技術(shù)路線：tumor-agnostic -assays(腫瘤未知分析)和tumor-informed assays(腫瘤知情/先驗(yàn)分析)，其中tumor-agnostic -assays僅對血漿檢測，利用的是固定的panel（一般為驅(qū)動基因和靶向藥物基因，也會多組學(xué)方法）和分析方法對ctDNA做檢測，做分析，代表產(chǎn)品Guardant Health公司的Guardant Reveal；tumor-informed assays需要對原發(fā)腫瘤組織進(jìn)行測序（一般為WES），來鑒定患者的特異基因組變異圖譜，然后再定制個(gè)性化的panel，針對ctDNA做檢測，也就是說需要對組織和血漿都做檢測，代表產(chǎn)品為Natera公司的Signatera。國內(nèi)IVD公司對MRD的檢測，截至發(fā)稿前，小編遇到的tumor-informed assays為多。

Fig 1. 針對MRD的檢測兩種檢測技術(shù)路線

MRD技術(shù)難度很大的一個(gè)方面是對超低頻突變的檢測能力和穩(wěn)定性，以非小細(xì)胞肺癌為例，在早期NSCLC患者血漿中位cfDNA的濃度為7.69 ng/mL，換算在10 mL血漿(20ml全血)中含有大概20,000個(gè)單倍體基因組（3.3pg），考慮到cfDNA建庫時(shí)的損耗以及至少存在2條相同的變異基因序列，10 mL血漿中ctDNA檢測到的極限分子信號為0.02%水平，另外, 從TRACERx研究數(shù)據(jù)推算, 在1 cm3體積的腫瘤情況下, 10 mL血漿中大概含有2條腫瘤來源DNA分子。因此, 在NSCLC中進(jìn)行MRD檢測時(shí), 該檢測方法必須可穩(wěn)定檢測出豐度≥ 0.02%的ctDNA。這里有個(gè)重要的技術(shù)策略，就是Sample Level的策略，對于Site level的0.02%甚至更低，可以通過Samples Level來提高靈敏度。

針對ctDNA檢測的MRD診斷IVD的開發(fā)，少不了的是性能評價(jià)，自然也是少不了標(biāo)準(zhǔn)品的開發(fā)，科佰生物是一家專注IVD研發(fā)中診斷陽性參考品、檢測限參考品、精密度參考品的研發(fā)生產(chǎn)型企業(yè)，針對ctDNA的超低頻標(biāo)準(zhǔn)品的開發(fā)，我們推出我們MRD的標(biāo)準(zhǔn)品：Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard

這是一款多基因多位點(diǎn)的panel標(biāo)準(zhǔn)品，基因和位點(diǎn)覆蓋范圍廣，突變類型豐富，十分適合作為LDT和IVD檢測的參考品、質(zhì)控品。

科佰生物在其中挑選了40+位點(diǎn)（病理學(xué)分級意義的位點(diǎn)）開發(fā)ddPCR，采取Fig 2/Fig 3的策略對低頻、超低頻的位點(diǎn)進(jìn)行定標(biāo)：

Fig 2. Serial Dilution assay for MRD reference standard

Fig 3. 如何對低頻、超低頻的頻率進(jìn)行定標(biāo)？科佰生物采取了1和4的方法開展定標(biāo)。

科佰生物針對Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard的產(chǎn)品，選擇了30+基因40+位點(diǎn)（部分基因位點(diǎn)ddpcr數(shù)據(jù)正在驗(yàn)證中），全部開發(fā)ddPCR檢測體系，精確定標(biāo)0.5%的頻率波動，選擇了6個(gè)基因7個(gè)位點(diǎn)作為0.05%的稀釋倍數(shù)驗(yàn)證，選擇2個(gè)基因2個(gè)位點(diǎn)作為0.005%的稀釋倍數(shù)驗(yàn)證。

Table 2. MRD標(biāo)準(zhǔn)品-0.5%經(jīng)過ddPCR精確定標(biāo)的基因，黑色為0.5%的驗(yàn)證基因，紅色是用于稀釋倍數(shù)驗(yàn)證的基因。

Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard包含多種突變類型，有SNV/Insertion/Deletion/Fusion，在突變類型上，有Missense/Nonsense/Deletion - In frame/Deletion - Frameshift/Insertion - In frame/Insertion - Frameshift/Translocation/Spice-site等等，在臨床的病理分級上基本都是Pathogenic/Likely Pathogenic，具體位點(diǎn)明細(xì)如下：

Table 3. Package-RefTM MRD Cocktail Reference Standard-0.5%的部分位點(diǎn)展示，黑色為目標(biāo)位點(diǎn)，紅色為用于稀釋倍數(shù)驗(yàn)證的位點(diǎn)。

科佰生物內(nèi)部還在進(jìn)一步開發(fā)更多的位點(diǎn)，產(chǎn)品還會進(jìn)一步升級。